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凝膠過濾膜的新用途-賽多利斯實驗室

[2019/3/26]

通過使用水溶性12602 Sartorius Stedim Biotech凝膠過濾膜采集病毒，在德國格賴夫斯瓦爾德的一家兒童綜合診所檢測經空氣傳播的甲型（H3N2）流感病毒。

引言

雖然基于撞擊原理撞擊采集器早就證明了其采集微生物氣溶膠的可靠性，但是隨著水溶性凝膠過濾技術的發展以及這種過濾膜僅在采集細菌氣溶膠方面廣泛的應用，直到總部位于哥廷根的賽多利斯斯泰帝生物技術有限公司開始商業化生產這種凝膠過濾膜之后，才使得過濾法在最近獲得越來越多的關注。

 

迄今為止，凝膠膜用于檢測和采集病毒氣溶膠的價值被認為是有限的，且凝膠膜還可以用于采集穩定的抗性病毒（如果有用的話）。截止到目前，這方面的實驗數據都非常少。

 

Jaschhof團隊使用Sartorius Stedim Biotech凝膠過濾膜（12602）對通過實驗產生的T1和T3大腸桿菌噬菌體和A|PR|8|34（H1N1）流感病毒的靜止氣溶膠進行采集，對這些病毒的采集實現了恒定的采集效率，即使在高入口速度（最高達1.6m/s）和延長采集時間（最長15分鐘）的條件下也是如此。


凝膠過濾膜對機械應力的高耐性和已證實的流感病毒的穩定性是在1990年初（第3-5周）急性呼吸道疾病（ARD）發病呈季節性上升期間測試該方法在實踐中有效性的原因。本研究建立在通過實驗產生的病毒和噬菌體氣溶膠的測試結果基礎上。

 

在格賴夫斯瓦爾德兒童綜合診所的候診室內抽取空氣樣本3天，然后將水溶性過濾材料用于病毒培養實驗。平行進行了實驗，培養從候診室中新患有急性呼吸道疾病的兒童抽吸獲得的鼻分泌物中分離的病毒。


材料和方法

研究地點

格賴夫斯瓦爾德兒童診所的候診室（約120 m³），兩個小時內最多有在父母陪同下的57名兒童（1990年1月24日）。溫度：25°C，60% 相對濕度。


實驗 | 測試材料：

新患有急性呼吸道疾病兒童的鼻分泌物。凝膠過濾膜，12602，過濾1.8m³的室內空氣后。然后將其與5ml等滲緩沖液一起密封在聚乙烯袋中，用于在pH 7.4下用0.5％酵母提取物（Difco）、青霉素G（400μl/ml）和鏈霉素（400μg/ml）進行細胞培養。

所有樣本在4小時內進行處理（期間儲存在冷卻室中）。

流感病毒A|PR|8|34（H0N1）的掃描電子顯微照片。

來自11天齡胚胎雞蛋培養物的病毒，經蔗糖密度梯度純化。

顯微照片：Herrmann|Fischer


空氣取樣

通過Sartorius Stedim Biotech凝膠過濾膜（12602-050）采集15分鐘，每個過濾膜（120 I/min）的樣本經3天過濾1.8m³的空氣獲得。


病毒學分析

鼻分泌物：加入漢克氏溶液（每個樣本3ml），將樣本離心30分鐘（3,000rpm），每毫升上清液添加10μl抗生素溶液，在室溫下培育1小時。用這些標本接種10天齡孵育蛋的羊膜，在33℃下孵育3天；準備3個無標記次培養；HAT用于檢測病毒。


空氣樣本：過濾膜在37℃的水浴中液化5分鐘；將上述抗生素溶液加入到用于接種孵育蛋的溶液中；然后培養FL細胞和腹水腫瘤細胞；根據HAT、CPE和HAdT的常規技術檢測病毒。


通過在HAHT中采用兔流感病毒免疫血清 A|格賴夫斯瓦爾德|1|89（H1N1）和A|格賴夫斯瓦爾德|1|90（H3N2）以及流感病毒A|四川|2|87（H3N2）和流感病毒A|格賴夫斯瓦爾德|2|88（H3N2）的抗原進行交叉滴定，對從鼻分泌物和空氣樣本中分離出的流感病毒進行歸類和鑒定。

 

通過PAGE測定v-RNA和病毒蛋白質圖譜。


結果與討論

從1990年1月24日采集的實驗材料中，在第三次傳代培養的孵育卵中成功接種從鼻分泌物中分離的三種類型的病毒和從空氣樣本中分離的甲型流感病毒（流感病毒A|格賴夫斯瓦爾德|2|90[H3N2]）。


HAT顯示分離的病毒和變體A|格賴夫斯瓦爾德|2|88和A|四川|2|87的抗原在很大程度上是相關的，與使用凝膠膜進行空氣取樣時從候診室內的患者身上所取的鼻分泌物標本培養的菌株無任何差異（流感病毒A|格賴夫斯瓦爾德|1|90[H3N2]）。

 

分離的病毒蛋白（HA、NP、NS和M）及其v-RNA的所有條帶在PAGE（聚丙烯酰胺凝膠電泳）后的遷移率高度匹配（圖1）。使用細胞培養物嘗試從空氣樣本中進一步分離病毒未成功。

圖 1：

在聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）時，從流感病毒A|格賴夫斯瓦爾德|1|90（H3N2）（從患者標本中分離）和流感病毒A|格賴夫斯瓦爾德|2|90（從空氣中采集和分離）中分離v-RNA。三醋酸EDTA緩沖液中3.5%的聚丙烯酰胺凝膠。

 

空氣樣本在急性呼吸道疾病發病流行前采集的事實證明了用于檢測空氣中流感病毒的過濾器采集方法的有效性。

 

研究當天有75%的兒童（≥8歲）患有呼吸道感染，但最多只有40%的兒童出現急性卡他性癥狀（咳嗽、打噴嚏、流鼻涕）。在該地區急性呼吸系統疾病季節性發病率略有上升期間的兒童診所候診室的空氣中檢測到甲型流感病毒，顯著證實了使用實驗產生的大腸桿菌噬菌體和甲型流感病毒靜止氣溶膠得到的結果。


這樣首次證明了凝膠過濾器在實踐中適合從空氣中采集呼吸道病毒。


展望

考慮到簡單的空氣過濾方法涉及到的工作較少，這種使用凝膠過濾膜的原理必將得到越來越多的認可，有助于解答關于感染性病毒氣溶膠的產生、穩定性和擴散的眾多問題（例如遺傳工程技術中）。