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典型PCR操作程序與優化方法

[2015/9/14]

一、試劑
1引物根據待擴增DNA不同,引物亦不同。
2耐熱DNA聚合酶:此酶是從耐熱細菌中分離出來的,能耐受高溫93~100℃)。
310x PCR緩沖液:500mm01LKCl; 100mmolLTris-HClpH8.420c150mmolLMgCl2lmgm1明膠。
45mmo1LdNTP貯備液:將dATP,dCTP,dGTPTdTTP鈉鹽各100mg合并,加3m1滅菌去離子水溶解,用NaOH調pH至中性,分裝每份300v1,-20℃保存,dNTP濃度最好用uv吸收法精確測定。
5標本處理試劑:不同標本所需試劑不同,根據具體情況而定

二、操作程序
利用PCR擴增的操作程序基本相同,只是根據引物與靶序列的不同,選擇不同的反應體系與循環參數,基本的操作是將PCR必需反應成分加入一微量離心管中,然后置于一定的循環參數條件下進行循環擴增。每個實驗室或每個人都有不同的操作習慣,但需遵守一定的操作規范。推薦下述操作程序,因這樣操作可最大程度地增加反應的成功率。
1向一微量離心管中依次加入:
ddH2O補至終體積終體積50~100ul
10xPCR緩沖液110體積
dNTP200umolL
引物各1umolL
DNA模板
混勻后,離心15s使反應成分集于管底。
2加石蠟油50~100ul于反應液表面以防蒸發。置反應管于97c變性7min染色體DNA5min質粒DNA。
3冷至延伸溫度時,加入1~5UTaqDNA聚合酶,在此溫度作用1min。
4于變性溫度下使模板DNA變性適當時間。
5在復性溫度下使引物與模板雜交一定時間。
6在延伸溫度下使復性的引物延伸合適的時間。
7重復4~625~30次。每次即為一個PCR循環。
8微量瓊脂德凝膠電泳檢查擴增產物。